1、實(shí)驗(yàn)部分

1.1儀器和試劑

SpectraMax M5型多功能酶標(biāo)儀（美國Molecular Devices公司）；MB100-4A型微孔板恒溫震蕩器（杭州奧盛儀器有限公司）；ZHLY-180型立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海知楚儀器有限公司）；Sigma 3K15型臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國希格瑪公司）；ProFlex型PCR儀（美國賽默飛公司）；DV-ⅢULTRA型粘度計(jì)（美國Brookfield公司）；旋轉(zhuǎn)滴法界面張力儀（芬蘭Kibron公司）；EZ-Pi Plus便攜式動(dòng)態(tài)表面張力儀（芬蘭Kibron公司）。

瓜爾膠為工業(yè)級(jí)，由長慶鈺宸公司提供；葡萄糖、NaCl、KH2PO4、Na2HPO4、MgSO4、NH4NO3、CuSO4、Na2MoO4·2H2O、FeSO4·7H2O、KCl、CaCl2、MnCl2·4H2O、D-?甘露糖和3，?5-?二硝基水楊酸（3，?5-Dinitrosalicylic acid，DNS）均為分析純試劑；胰蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、蛋白胨、植物凝膠和瓊脂均為生物試劑；細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒購買于德國凱杰QIAGEN公司；細(xì)菌16S rRNA基因通用引物8F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和805R（5'-GACTACCAGGGTATCTAATC-3'）由南京金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1樣品來源與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用的水樣是由長慶油田提供的壓裂液返排水，土樣采自云南省楚雄市魔芋生產(chǎn)田地。

富集培養(yǎng)基：胰蛋白胨15.0 g/L、大豆蛋白胨5.0 g/L、酵母粉2.5 g/L、葡萄糖2.5 g/L、NaCl 5.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L；固體初篩培養(yǎng)基：瓜爾膠10.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、植物凝膠15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L；復(fù)篩培養(yǎng)基：瓜爾膠10.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、微量元素1.0%（體積分?jǐn)?shù)）；發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基：瓜爾膠15.0 g/L、NH4NO3 1.0 g/L、KH2PO4 2.5 g/L、Na2HPO4 4.0 g/L、MgSO4 0.2 g/L、酵母粉0.5 g/L、微量元素1.0%（體積分?jǐn)?shù)）；微量元素配方：CuSO4 0.1 g/L、Na2MoO4·2H2O 0.1 g/L、FeSO4·7H2O 2.0 g/L、CaCl2 1.0 g/L、MnCl2·4H2O 0.5 g/L；種子培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L；LB固體培養(yǎng)基：蛋白胨10.0 g/L、酵母粉5.0 g/L、NaCl 10.0 g/L、瓊脂18.0 g/L。以上培養(yǎng)基在使用前，均在121℃高壓滅菌20 min。

1.2.2菌株的高通量篩選

稱取1.0 g魔芋地土樣于錐形瓶中（魔芋地的土壤環(huán)境適合β-甘露聚糖酶產(chǎn)生菌的生長），加入5.0 mL水樣和100.0 mL蒸餾水，在37℃、180 r/min的立式恒溫振蕩培養(yǎng)箱（搖床）中震蕩培養(yǎng)30 min，充分混勻后室溫靜置1 h，分層后取2.0 mL上層清液轉(zhuǎn)接于200.0 mL富集培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃、180 r/min恒溫震蕩48 h。取200.0μL富集培養(yǎng)的菌液均勻涂布于以瓜爾膠為唯一碳源的OD 90 mm（培養(yǎng)基直徑為90 mm）固體初篩培養(yǎng)基上，倒置培養(yǎng)60 h，之后用1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）剛果紅染液染色，觀察菌落周圍有無透明圈，挑取透明圈大的單菌落轉(zhuǎn)接到于裝有2.0 mL復(fù)篩培養(yǎng)基的96孔培養(yǎng)板中繼續(xù)培養(yǎng)，在微孔板恒溫震蕩器中37℃、500 r/min震蕩培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)后的發(fā)酵液置于臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（離心機(jī)）中，4℃、3000 r/min離心20 min，上清液即為粗酶液，根據(jù)瓜爾膠降解情況及酶活力大小進(jìn)行復(fù)篩，同時(shí)進(jìn)行甘油保藏（甘油和LB溶液的體積比為1∶1）。

1.2.3菌株的形態(tài)觀察及種屬鑒定

形態(tài)特征觀察將篩選得到的菌株接種于種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min活化培養(yǎng)，取對數(shù)生長期菌液稀釋涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37℃倒置培養(yǎng)，觀察菌落的形態(tài)特征。采用革蘭氏染色法，在顯微鏡下觀察菌體結(jié)構(gòu)，并通過掃描電子顯微鏡觀察菌體形態(tài)及大小。

分子生物學(xué)鑒定按照細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒說明書進(jìn)行DNA的提取，以基因組DNA為模版，采用細(xì)菌的通用引物8F和805R進(jìn)行PCR（聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)）擴(kuò)增。對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至上海華大基因科技有限公司測序。將測序結(jié)果在NCBI數(shù)據(jù)庫中（http：//www.ncbi.nlm.gov/blast/）進(jìn)行BLAST同源性比對（BLAST是在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性分析的工具），并利用MEGA軟件的N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.2.4酶活力的測定

采用3，5-二硝基水楊酸法對β-甘露聚糖酶酶活力進(jìn)行測定，用pH=7.0的PBS緩沖液（每100 mL PBS緩沖液由38 mL 0.2 mol/L的Na2HPO4和62 mL 0.2 mol/L的KH2PO4配成）配制0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓜爾膠底物溶液。反應(yīng)體系包含50.0μL粗酶液和450.0μL的瓜爾膠底物溶液，50℃反應(yīng)10 min后，加入1.0 mL的DNS試劑終止反應(yīng)，沸水浴10 min顯色后，立刻冰水浴冷卻至室溫。取200.0μL反應(yīng)液轉(zhuǎn)移至96孔板中，在540 nm處用多功能酶標(biāo)儀測定吸光度，實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行，結(jié)果取平均值。以不同濃度D-甘露糖為標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算產(chǎn)生的還原糖量。在一定溫度和pH值條件下，1 min催化底物水解產(chǎn)生1.0μmol相當(dāng)于D-甘露糖的還原糖所需要的酶量，定義為1.0個(gè)酶活力單位。采用Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度，比活的定義為：每毫克酶蛋白所具有的酶活力。

1.2.5酶學(xué)性質(zhì)表征

粗酶液的制備在無菌環(huán)境下將篩選得到的菌株接種到種子培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min活化培養(yǎng)24 h，按5.0%的接種量轉(zhuǎn)接到發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min搖床培養(yǎng)72 h，將發(fā)酵液于4℃下，9000 r/min離心20 min，收集上清液，上清液即為粗酶液，于4℃冰箱冷藏備用。

最適溫度按照1.2.4小節(jié)的方法分別在不同溫度：5、10、15、20、25、30、35、40、50、60、70、80、90和100℃下反應(yīng)，測定β-甘露聚糖酶活力。以未經(jīng)處理的同溫度下的瓜爾膠底物溶液作為空白對照。以最適溫度下的酶活力為100%，計(jì)算不同溫度下的相對酶活力。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置3個(gè)平行樣，結(jié)果取平均值（下同）。

最適pH值分別用pH值為2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0和12.0的緩沖液配制0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓜爾膠底物溶液，按照1.2.4小節(jié)的方法在最適溫度下測定β-甘露聚糖酶活力。以未經(jīng)處理的相同pH值的瓜爾膠底物溶液作為空白對照。以最適pH值下的酶活力為100%，計(jì)算不同pH值下的相對酶活力。

熱穩(wěn)定性將粗酶液分別在60、70和80℃的恒溫水浴中孵育1 h，孵育期間每隔10 min取50.0μL該粗酶液加入瓜爾膠底物溶液中，按照1.2.4小節(jié)的方法在最適反應(yīng)條件下測定β-甘露聚糖酶的殘余活力，以評(píng)價(jià)酶的熱穩(wěn)定性。

pH值穩(wěn)定性將粗酶液分別在pH值為4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的緩沖液中孵育2 h，孵育期間每隔20 min取50.0μL該粗酶液加入瓜爾膠底物溶液混勻。按照1.2.4小節(jié)的方法在最適條件下測定β-甘露聚糖酶的殘余活力，以評(píng)價(jià)酶的pH值穩(wěn)定性。

1.2.6低溫降解瓜爾膠

配制0.8%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的瓜爾膠底物溶液，加入1.0%（體積分?jǐn)?shù)）的粗酶液，分別在5和20℃下恒溫水浴，測定不同作用時(shí)間下瓜爾膠溶液的粘度變化，每次測量3次取平均值。以未經(jīng)處理的瓜爾膠溶液作為空白對照，評(píng)價(jià)反應(yīng)溫度為5和20℃時(shí)，β-甘露聚糖酶對瓜爾膠的降粘效果。降粘率（Viscosity Reduction Rate，VRR）的計(jì)算如公式（1）所示：

式中，μ0為降粘前的粘度（mPa?s），μ1為降粘后粘度（mPa?s）。

1.2.7破膠性能評(píng)價(jià)

壓裂液的配制按照國標(biāo)SY/T 5107-2016《水基壓裂液性能評(píng)價(jià)方法》中壓裂液試樣制備方法制備壓裂液。壓裂液配方為：基液：0.35%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）瓜爾膠、1.0%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）KCl、0.1%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）殺菌劑、0.18%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）Na2CO3、0.036%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）NaHCO3；交聯(lián)液：1.0%（體積分?jǐn)?shù)）硼砂溶液，交聯(lián)劑比為100∶5（體積比）；酶破膠劑：1.0%（體積分?jǐn)?shù)）。

粘度的測定按配方配制壓裂液，將加入酶破膠劑的凍膠分別置于5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80和90℃的恒溫水浴中，在破膠3和6 h時(shí)取其上層清液，于室溫下用粘度計(jì)測定破膠液的粘度，每次測量3次取平均值（下同）。

表面張力和界面張力的測定待壓裂液交聯(lián)后，加入酶破膠劑，分別在10、20和50℃的恒溫水浴中破膠3 h，待破膠液的粘度降低到5 mPa·s以下后，將破膠液倒入燒杯中，用表面張力儀測定破膠液的表面張力，用界面張力儀測定破膠液與煤油界面張力，測試溫度為50℃。

殘?jiān)康臏y定按照國標(biāo)SY/T 5107-2016《水基壓裂液性能評(píng)價(jià)方法》中指出的殘?jiān)康臋z測方法進(jìn)行測定。制備定量體積V0的壓裂液凍膠，加入酶破膠劑，分別置于10、20和50℃的恒溫水浴中破膠。室溫測定破膠液粘度低于5 mPa·s時(shí)視為徹底破膠。將徹底破膠后的溶液全部轉(zhuǎn)移到已經(jīng)烘干稱重的離心管中（質(zhì)量記為m0），在離心機(jī)中5000 r/min離心30 min，慢慢倒出上層清液，然后用蒸餾水清洗破膠容器后倒入離心管中，再次離心20 min并倒出上層清液。將離心管放入干燥箱中105℃下烘干至恒重（質(zhì)量記為m1）。壓裂液殘?jiān)坑?jì)算如公式（2）所示：

式中，η為壓裂液殘?jiān)|(zhì)量濃度（mg/L）；（m1-m0）為殘?jiān)|(zhì)量（mg）；V0為壓裂液用量（mL）。

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——摘要

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——實(shí)驗(yàn)部分

產(chǎn)低溫β-甘露聚糖酶的菌株O5提升低溫油藏壓裂液的破膠性能——結(jié)果與討論、結(jié)論